一、KI小鼠模型構(gòu)建技術(shù)路線(xiàn)選擇

二、KI小鼠模型構(gòu)建CRISPR-HDR方案（短片段插入推薦）

1. 靶點(diǎn)設(shè)計(jì)與供體制備

• gRNA設(shè)計(jì)：

• 靶向插入位點(diǎn)（避開(kāi)功能域），使用CHOPCHOP優(yōu)化效率。

• 供體DNA設(shè)計(jì)：

5'同源臂 60-100nt

目標(biāo)序列+篩選標(biāo)記*

3'同源臂 60-100nt

• 化學(xué)修飾：ssODN（單鏈）需3'硫代磷酸酯化，dsDNA（雙鏈）需磷酸化。

• 沉默突變：在gRNA靶區(qū)引入1-2 bp突變防止重切（必需！）。

2. 受精卵注射

• 注射混合物：

• Cas9蛋白 (50 ng/μL) + gRNA (25 ng/μL) +       ssODN/dsDNA (100 ng/μL)。

• 胚胎移植：

• 移植20-30個(gè)注射后胚胎至假孕母鼠。

3. 基因型鑒定

• PCR策略：

• 外側(cè)引物（同源臂外） + 內(nèi)側(cè)引物（插入序列內(nèi)）→ 僅陽(yáng)性鼠能擴(kuò)增。

• 測(cè)序驗(yàn)證：確保插入序列無(wú)indel突變。

4. 品系建立

• F0嵌合體：與野生型交配，篩選生殖系傳遞后代（通常50%概率）。

三、ES細(xì)胞同源重組方案（大片段KI）

1. 靶向載體構(gòu)建

5'同源臂 1.5-3kb

目標(biāo)序列

FRT-flanked NeoR

3'同源臂 1.5-3kb

DTA負(fù)選標(biāo)記

• 關(guān)鍵元件：

• 同源臂：長(zhǎng)度與插入片段正相關(guān)（>5 kb插入需≥3 kb同源臂）。

• 篩選標(biāo)記：NeoR（后續(xù)可通過(guò)Flp刪除）。

2. ES細(xì)胞操作

• 電轉(zhuǎn)與篩選：

• G418（NeoR）篩選10-14天，Pick 200-300個(gè)克隆。

• 陽(yáng)性克隆驗(yàn)證：

• 長(zhǎng)片段PCR（覆蓋整個(gè)插入?yún)^(qū)域）。

• Southern blot：確認(rèn)單拷貝整合。

3. 小鼠制備

• 囊胚注射：將陽(yáng)性ES細(xì)胞注入C57BL/6N囊胚。

• 傳代：嵌合體與Flp deleter小鼠交配刪除NeoR。

四、條件性KI（cKI）附加設(shè)計(jì)

1. 雙loxP系統(tǒng)

• 策略：在目標(biāo)基因前插入loxP-stop-loxP（LSL）結(jié)構(gòu)，與Cre小鼠交配后激活表達(dá)。

• 應(yīng)用：

• 報(bào)告基因：Rosa26-LSL-tdTomato。

• 致癌基因：Kras-LSL-G12D。

2. 誘導(dǎo)型系統(tǒng)

• Tet-On：rtTA + TRE-目標(biāo)基因，需多xi環(huán)素誘導(dǎo)。

五、經(jīng)典KI模型案例

六、關(guān)鍵優(yōu)化策略

1. 提高HDR效率：

• 添加HDR增強(qiáng)劑（如Rad51 mRNA或RS-1）。

• 使用Cas9變體（如Cas9-D10A nickase）。

2. 減少隨機(jī)整合：

• 線(xiàn)性化供體DNA（避免質(zhì)粒骨架整合）。

3. 表型驗(yàn)證：

• mRNA水平：qPCR檢測(cè)插入基因表達(dá)。

• 蛋白水平：抗體檢測(cè)（如HA/FLAG標(biāo)簽）。